韩少坤:病毒入侵和转基因都形成包涵体

2021-10-20
作者: 韩少坤 来源: 博客中国

  当生命体有病毒等外敌入侵时,会产生许多防御结构,常见的就是包涵体,以阻止病毒进一步侵入和阻止外敌的毒性物质,包涵体就是由异常纤维蛋白聚集体组成的钙化灶。人体癌细胞中的砂粒体(即包涵体)也是由异常纤维蛋白聚集体组成的钙化灶。

  包涵体:病毒在增殖的过程中,常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构。一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成;少数则是宿主细胞对病毒感染的反应产物,不含病毒粒子。

  外源基因假借宿主细胞的代谢系统,合成重组蛋白。当外源基因过多表达时,就会激起宿主细胞的防卫,对外源重组蛋白产生包涵体(钙化灶)。胰岛素、干扰素、乙肝表面抗原疫苗等基因工程药物分子大多存在于包涵体中。

  包涵体主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒DNA和其它杂质。通过破碎菌体收集包涵体、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化等,获得相关重组蛋白药物。
 

  附文1. 包涵体https://baike.so.com/doc/5330137-5565311.html

  病毒在增殖的过程中,常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构,在光学显微镜下可见。多为圆形、卵圆形或不定形。一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成;少数则是宿主细胞对病毒感染的反应产物,不含病毒粒子。有的位于细胞质中(如天花病毒包涵体),有的位于细胞核中(如疱疹病毒),或细胞质、细胞核中都有(如麻疹病毒)。有的还具有特殊名称,如天花病毒包涵体叫顾氏(Guarnieri)小体,狂犬病毒包涵体叫内基氏(Negri)小体。

  包涵体是外源基因在原核细胞中表达时,尤其在大肠杆菌中高效表达时,形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒,在显微镜下观察时为高折射区,与胞质中其他成分有明显区别。包涵体形成是比较复杂的,与胞质内蛋白质生成速率有关,新生成的多肽浓度较高,无充足的时间进行折叠,从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体;此外,包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件,如培养基成分、温度、pH值、离子强度等因素有关。细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在,功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体,不具有生物学活性。

  注:包涵体是细胞生物最原始的防御结构,包涵体包裹钙化外来异物,形成钙化灶。癌细胞中砂粒体就是钙化灶。

  附文2.基因工程乙肝疫苗(酵母重组)的生产工艺:

  重组酵母乙肝疫苗是一种乙肝表面抗原(HbsAg)亚单位疫苗,它系采用转基因的方法将乙肝病毒表达表面抗原的基因进行质粒构建,转入进入啤酒酵母菌或者汉逊酵母中,通过培养这种重组酵母菌来表达乙肝表面抗原亚单位。

  基因工程乙肝疫苗(酵母重组)的生产工艺包括发酵、提取、纯化、吸附、配制、分装等工序。生产工艺中采用世界一流的发酵罐,通过全自动控制,提供酵母菌最优生长条件,发酵后经过细胞破碎和一系列微滤、超滤、硅胶吸附、洗脱等工序,再经过疏水层析,可使产品抗原蛋白纯度达99%以上。所有工艺设备可自动清洗、自动灭菌,有效地减少了种种人为因素的干扰,确保生产稳定和质量一致性。

  附文3. IFN-α(α干扰素)重组蛋白包涵体溶解和蛋白纯化复性

  https://wenku.baidu.com/view/9b6bf41004a1b0717ed5dd73.html

  附文4. 人胰岛素原在基因工程菌中的高效表达

  每升发酵培养基可得湿菌体约43g,包涵体约14g。

  http://www.cqvip.com/qk/93340x/200501/11848412.html

  附文5. 包涵体蛋白纯化http://www.sohu.com/a/100094407_401351

  包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒DNA和其它杂质。洗涤常用1%以下的中性去垢剂,如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA和还原剂2-巯基苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇等反复多次进行,因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强,在洗涤包涵体时可加50mMNaCL。这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上,而且可保持元结构。也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜,使用的还原剂为0.1-5mM。EDTA为0.1-0.3mM。去垢剂如TritonX-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白OmpT(37KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。

  包涵体最后的纯化,一般是离子交换,疏水,或者是亲和层析,亲和层析尤其是金属螯合层析用得比较广泛,而纯化的效果也不错,通常是一步就能达到纯度为95%以上的包涵体。

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